外泌體是什么？ |外泌體分離的方法與差異

外泌體是細(xì)胞釋放的微小囊泡，因?yàn)楹猩锓肿尤绲鞍踪|(zhì)和DNA、RNA序列，所以能夠影響周?chē)?xì)胞的功能，在細(xì)胞間通訊和疾病機(jī)制中扮演關(guān)鍵角色。 透過(guò)了解外泌體分離的方法，我們能夠研究細(xì)胞間訊息傳遞的機(jī)制，從而揭示許多疾病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程。

什么是胞外囊泡/外泌體？

細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles， EVs） 是由細(xì)胞分泌而形成，是一種無(wú)法自行復(fù)制的生物納米球狀脂雙層囊泡結(jié)構(gòu)。 這些囊泡存在于多種生物體液中，如唾液、尿液、血液、血清、腦脊液、乳汁等，也可能出現(xiàn)在細(xì)胞培養(yǎng)液中。
細(xì)胞外囊泡包含多種訊號(hào)因子及生物標(biāo)記，如核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)，可作為細(xì)胞間信號(hào)傳遞、溝通的媒介，調(diào)控生理與病理機(jī)制。 根據(jù)尺寸及生物起源的不同，胞外囊泡可分為外泌體 （exosomes）、微囊泡 （microvesicles， MVs） 及凋亡小體 （apoptotic bodies） 三大類(lèi)別。

胞外囊泡/外泌體之命名與生物起源

值得注意的是，由于各種細(xì)胞外囊泡的生物起源難以明確判別，因此國(guó)際胞外囊泡協(xié)會(huì)（International Society for Extracellular Vesicles， ISEV）于 MISEV2018指南中，建議改以下列方式命名：

不同的外泌體種類(lèi)命名方式

外泌體來(lái)源

相較于脂質(zhì)體、奈米粒子等合成載體，外泌體來(lái)源具有內(nèi)源性及異質(zhì)性等特性，使得外泌體可作為優(yōu)良載體，能透過(guò)多種途徑和位點(diǎn)將具有生物活性的物質(zhì)運(yùn)送至目標(biāo)細(xì)胞參與調(diào)節(jié)，如組織修復(fù)、免疫調(diào)節(jié)、血管新生、細(xì)胞分化、腫瘤形成等。

因此，外泌體在疾病診斷、*和生物研究方面，具有很大的潛力及優(yōu)勢(shì)，如作為腫瘤診斷的生物標(biāo)記、癌病*的藥物載體等。

外泌體缺點(diǎn)

然而，外泌體也存在著一些限制，如低穩(wěn)定性、低產(chǎn)量、低純度以及弱標(biāo)靶性等因素，都可能會(huì)限制其臨床應(yīng)用。

外泌體分離的方法與差異

隨著對(duì)外泌體的研究不斷深入，其潛在應(yīng)用價(jià)值也持續(xù)不斷地被發(fā)掘。 外泌體的分離、純化及濃縮（又稱富集，enrichment）對(duì)于評(píng)估其生物學(xué)功能及其下游應(yīng)用至關(guān)重要。

然而，外泌體萃取因生物樣品的成份復(fù)雜，內(nèi)含許多相似的分子結(jié)構(gòu)，如細(xì)胞碎片、蛋白聚集體、脂蛋白等，且外泌體的大小、組成具有異質(zhì)性，使得外泌體分離更具有挑戰(zhàn)性。 因此，如何有效地分離與濃縮外泌體是學(xué)術(shù)研究及臨床應(yīng)用中面臨的一大考驗(yàn)。

常見(jiàn)的外泌體分離方式比較

外泌體分離的方法很多種，依原理不同，常見(jiàn)方法為超速離心法、粒徑篩析層析法、超過(guò)濾法、沉淀法和免疫親和法，下表統(tǒng)整了各方法的差異：

*1超速離心法 （UC）又稱為差速心法 （Differential ultracentrifugation， dUC）
*2使用專業(yè)純化 kit 可于20分鐘內(nèi)完成EVs純化
*3高擴(kuò)展性是指 TFF 切向流過(guò)濾法 （ Tangential Flow Filtration)

傳統(tǒng)超濾與切向流過(guò)濾的優(yōu)劣勢(shì)分析

超過(guò)濾法 （UF） 是以分子大小進(jìn)行分離的方法，其中又可細(xì)分為以離心驅(qū)動(dòng)的超濾離心管、壓力驅(qū)動(dòng)的攪拌式過(guò)濾器及切向流過(guò)濾 （tangential flow filtration， TFF） 三種類(lèi)型。
超濾離心管及攪拌式過(guò)濾器的作簡(jiǎn)單、處理時(shí)間快，但*的問(wèn)題是濾膜易堵塞 （clogged），不僅降低分離效率且成本高; 而切向流過(guò)濾技術(shù) （TFF） 的發(fā)展則可大幅解決濾膜堵塞的問(wèn)題。

TFF切向流過(guò)濾技術(shù)用于外泌體分離

多篇文獻(xiàn)也指出TFF用于EVs分離時(shí)，不論產(chǎn)量、再現(xiàn)性、去污染能力都比稱為EV純化的黃金標(biāo)準(zhǔn)的超速離心法（UC or dUC）來(lái)得*，甚至節(jié)省了40%以上的時(shí)間，更適合大規(guī)格量產(chǎn)的應(yīng)用。
各方法的詳細(xì)比較及TFF &UC的EV分離數(shù)據(jù)，可觀看'EXOSOME外泌體純化在線研討會(huì)直播精華'。

盡管現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)展出各種外泌體分離方法，但這些方法仍存在缺點(diǎn)，無(wú)法完全滿足分離外泌體的高純度及高產(chǎn)率需求。 為了提高外泌體的分離效率和濃縮程度，許多研究團(tuán)隊(duì)已經(jīng)開(kāi)始嘗試結(jié)合多種分離方法; 截至目前，已有研究指出，多種分離方法比單一分離方法能更有效地提高產(chǎn)量和純度。 例如，結(jié)合 UC 和 UF 初步萃取外泌體，再利用 IA 進(jìn)一步純化目標(biāo)外泌體。 或者可以結(jié)合 UC 和 SEC，不僅可以處理大體積樣品，還可以有效減少污染物的干擾。 在選用結(jié)合方法時(shí)，應(yīng)注意各別單一方法對(duì)目標(biāo)外泌體是否會(huì)造成不良影響，如外泌體變性、失活等問(wèn)題。 以下為 TFF 搭配各種技術(shù)進(jìn)行外泌體的分離方法。

*LSC：Low speed centrifugation，低速離心法

外泌體的應(yīng)用

• 疾病診斷/預(yù)后：作為生物標(biāo)記用于精準(zhǔn)醫(yī)療及預(yù)測(cè)病程，如阿爾茨海默癥、帕金森氏癥、自體免疫疾病、神經(jīng)退化性疾病、癌癥等
• 疾病* ：分子藥物、*劑、藥物載體及傳遞用于癌癥*及再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域
• 生物研究：DNA、miRNA 等，了解各疾病的生理及病理機(jī)制

參考文獻(xiàn)：

• A Review of Exosomal Isolation Methods: Is Size Exclusion Chromatography the Best Option, Sidhom et al., International Journal of Molecular Science, 2020
• Biological Functions Driven by mRNAs Carried by Extracellular Vesicles in Cancer, Prieto-Vila et al., Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 2021
• Exosome: A Review of Its Classification, Isolation Techniques, Storage, Diagnostic and Targeted Therapy Applications, Zhang et al., International Journal of Nanomedicine, 2020
• Isolation of extracellular vesicles with combined enrichment methods, Stam et al., Journal of Chromatography B, 2021
• Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018)-a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines, Journal of Extracellular Vesicles, 2018
• Multiplexed strategies toward clinical translation of extracellular vesicles, Song et al., Theranostics, 2022
• Progress in Exosome Isolation Techniques, Li et al., Theranostics, 2017
• Review on Strategies and Technologies for Exosome Isolation and Purification, Chen et al., Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 2022